Prinsip dasar pemurnian protein dengan menggunakan metode ultrasentrifugasi adalah memisahkan partikel-partikel protein yang berbeda dengan memanfaatkan perbedaan berat atau densitas molekul-molekul yang terkandung dalam larutan. Dalam metode ultrasentrifugasi, proses pemisahan molekul-molekul protein berdasarkan berat dan densitas yang berbeda menggunakan insturmen yang bekerja untuk memutar secara rotasi larutan campuran protein dalam suatu wadah dengan kecepatan tinggi agar gaya sentrifugasi bekerja pada larutan sehingga komponen protein dengan terfraksinasi, sehingga protein-protein yang diinginkan terpisah dengan komponen lainnya.
Gaya sentrifugasi yang bekerja pada partikel-partikel akan tergantung pada densitas atau massa dari partikel-partikel tersebut. partikel yang memiliki massa yang lebih besar akan mempunyai gaya sentrifugasi lebih besar dibandingkan dengan gaya sentrifugasi yang bekerja pada partikel dengan massa yang lebih kecil, sehingga partikel yang lebih besar akan mengimbangi gaya hambat dari larutan (drag force) yang menyebabkan partikel-partikel dengan massa yang lebih besar akan berada pada dasar wadah setelah proses sentrifugasi dilakukan. Sedangkan partikel dengan massa yang relatif lebih kecil akan berada pada bagian atasnya (Voelkl, 2016).
Konsep dasar metode Ultrasentifugasi
Untuk mempersiapkan proses sentrifugasi terdapat dua tahap yang dilakukan, yaitu sentrifugasi diferensial dan densitas gradien sentrifugasi.
Sentrifugasi diferensial
Sentrifugasi diferensial pada dasarnya memisahkan partikel-partikel berdasarkan bentuk dan ukurannya. Partikel-partikel berbeda pada awalnya bercampur dalam larutan buffer untuk menjaga protein pada pH optimalnya agar tidak terjadi denaturasi. Campuran kemudian dipisahkan menjadi dua fraksi yaitu; pellet, bagian yang mengandung sedimentasi partikel dan supernatan yang terdiri dari partikel tidak tersedimentasi dalam larutan buffer.
Seperti yang diilustrasikan pada gambar, komponen-komponen partikel akan terdistribusi secara berbeda menjadi pellet dan supernatan selama proses sentrifugasi, berdasarkan pada ukuran. Partikel yang mempunyai ukuran yang lebih besar akan cenderung untuk diendapkan pada bagian dasar (partikel berwarna putih). Sedangkan untuk partikel dengan ukuran yang lebih kecil cenderung akan berada pada supernatan (partikel titik hitam). Untuk pemisahan yang lebih baik, supernatant yang terbentuk dapat dipisahkan dan dilakukan sentrifugasi lagi dengan laju perputaran sentrifugasi yang lebih tinggi. Sementara pellet dapat di endapkan ulang dan sentrifugasi ulang untuk memisahkannya dari kontaminan (dicuci).
Sentrifugasi dengan gradien densitas
Pada tahapan sebelumnya, pemurnian protein tidak dapat secara murni diselesaikan karena ada partikel lain yang mungkin saja menjadi pengotor dalam endapan. Untuk mendapatkan protein yang benar-benar murni, dibutuhkan langkah untuk menghilangkan partikel kontaminan tersebut, yaitu dengan teknik yang dinamakan sentrifugasi gradient densitas. Alasan dilakukannya tahapan ini adalah untuk memisahkan partikel-partikel yang berbeda densitasnya menggunakan suatu medium dalam tabung yang mempunyai densitas berbeda, tidak seperti pada tahapan sebelumnya yang menggunaka densitas medium yang homogen.
Pada dasarnya densitas medium yang digunakan dapat ditingkatkan secara kontinyu atau diskontinyu (diskrit). Tujuannya agar pada masing-masing densitas medium yang berbeda dapat diendapkan partikel-partikel tertentu dengan densitas yang telah disesuaikan dengan densitas medium dalam tabung tersebut. Pada tahapan ini ada dua cara yang dapat digunakan yaitu rate zonal sentrifugasi dan isopycnic sentrifugasi. Meskipun keduanya menggunakan medium yang memiliki gradient densitas namun prinsipnya sangatlah berbeda. Pada pemurnian protein biasanya digunakan rate zonal sentifugasi yang biasanya menggunakan medium dengan gradien densitas yang kontinyu.
Rate zonal sentrifugasi pada protein memisahkan partikel pada medium yang mempunyai gradien densitas kontinyu dengan mengandalkan laju pengendapan partikel-partikel yang hendak dipisahkan. Laju pendengapan partikel-partikel tersebut dapat diketahui dari koefisien pengendapan partikel-partikel tersebut.
sampel yang hendak dimurnikan atau diseparasi pada mulanya dimasukkan pada medium dengan gradien densitas pada bagian paling atas, setelah gaya sentrifugasi bekerja pada medium tersebut, partikel-partikel akan terfraksinasi (terpisahkan) pada zona-zona yang sesuai dengan densitas pada medium tersebut. partikel-partikel dengan laju pengendapan yang sama akan berada pada zona yang sama pada medium tersebut.
Teknik Percobaan
Teknik percobaan untuk memurnikan protein dengan menggunakan metode ultrasentrifugasi dapat dilakukan dengan melibatkan tahap sentrifugasi diferensial atau tanpa tahap sentrifugasi diferensial terlebih dahulu. Jika protein-protein yang akan dimurnikan berasal dari suatu atau kumpulan sel yang masih banyak mengandung organel-organel yang dapat mengganggu maka protein dapat dipisahkan dengan menggunakan tahap sentrifugasi diferensial.
Protein akan cenderung berada pada supernatan ketika proses selesai dilakukan, sehingga supernatan yang didapatkan kemudian dilakukan tahap sentrifugasi gradien densitas yaitu dengan rate zonal sentrifugasi.
Persiapan Material dan Sampel
- OptiPrep (larutan steril 60% w/v Iodixanol dalam air) yang dibuat bergradien konsentrasinya, untuk menciptakan gradien konsentrasi dapat dibuat dengan mencampurkan OptiPrep dalam HED dengan 2mM MgSO4 dan 0,1% Lubrol PX sehingga didapatkan larutan 30% (w/v). Gradien akan terbentuk dengan mengenakan gaya sentrifugasi pada larutan yang telah dibuat di dalam rotor dengan kecepatan 100.000 rpm.
- Larutan sukrosa yang disiapkan dalam 20mM Hepes pH 8,0; 1 mM EDTA, 1mM DTT (HED), 2mM MgSO4 dan 0,1 % Lubrol PX. Medium sukrosa yang bergradien dapat dibuat dengan cara memasukkan secara berurutan larutan sukrosa yang sudah dibuat dengan konsentrasi 20%, 15%, 10%, dan 5% kedalam tabung sentrifugasi. Gradien konsentrasi yang telah dibuat dapat dicek dengan menggunakan refraktometer.
- Campuran protein yang akan dilakukan pemurnian atau pemisahan.
Sentrifugasi dan Gradien fraksinasi
Selama kurang lebih dua jam campuran material dan sampel protein disentrifugasi dengan menggunakan tabung untuk sentrifugasi dengan kecepatan 120.000 rpm. Selanjutnya akan dihasilkan larutan yang terfraksinasi bergradien. Larutan dipisahkan pada tabung-tabung reaksi yang berbeda untuk selanjutnya dilakukan tahapan pengujian protein.
Pengujian Protein
Masing-masing fraksi yang didapatkan selanjutnya dilakukan pengujian untuk meihat keberhasilan pemisahan protein-protein tersebut dengan cara membandingkannya dengan protein serum standar dengan metode elektroforesis. Masing –masing fraksi protein dilarutkan dengan setengah dari volume total yang mengandung larutan 60% gliserol, 15% b-mercaptoetanol, 6% sodium dodecyl sulfate, dan 0,001% bromfenol biru. Kemudian masing-masing fraksi dimasukkan kedalam sumur pada gel sodium dodecylsulfate polyacrylamide. Selanjutnya hasil pola migrasi dapat menentukan laju sedimentasi dan koefisien sedimentasi dari masing-masing fraksi protein dengan membandingkannya dengan hasil dari referensi.
Pada gambar diatas campuran protein (bovin serum albumin, BSA; ovalbumin, OVAL; karbonik anhidrase, CA; tripsin inhibitor kacang kedelai, STI; dan a-lactalbumin, LAC) dipisahkan dengan rate zonal sentrifugasi pada 200 µL sukrosa bergradien. (sebelah kiri diambil dari bagian paling atas hasil sentrifugasi, sebelah kanan bagian paling bawah).
Sudah selesai membaca materi ini ? Ayo lihat dulu Daftar Materi Kimia
